PCR的特異性、效率和忠實(shí)性是體現(xiàn)一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量的三個(gè)重要指標(biāo)。特異指一個(gè)PCR反應(yīng)只產(chǎn)生一個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物，即預(yù)期的靶序列。效率指每個(gè)循環(huán)里擴(kuò)增的實(shí)際產(chǎn)物的量與理論上應(yīng)該達(dá)到的量的接近程度。忠實(shí)是指在PCR反應(yīng)過程中，由DNA聚合酶誘導(dǎo)的錯(cuò)配是可以忽略不計(jì)的。

　　這三個(gè)參數(shù)中的每一個(gè)都受到PCR反應(yīng)中眾多成分的影響，包括緩沖體系、酶、模板甚至PCR循環(huán)程序，但遺憾的是，高特異性的反應(yīng)條件與高產(chǎn)量的反應(yīng)條件并不一致，同時(shí)高保真也往往導(dǎo)致低產(chǎn)率。因此在設(shè)計(jì)PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模嗅槍?duì)性地對(duì)這三個(gè)參數(shù)有側(cè)重地優(yōu)化。如在片段長度多態(tài)性分析時(shí)，PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性就比忠實(shí)性重要;而若是研究個(gè)別DNA分子或稀有突變，忠實(shí)性的重要性不言而喻。

　　特異性是PCR的基礎(chǔ)，它首先取決于引物設(shè)計(jì)與模板的互補(bǔ)。一套理想的引物能有效地與靶序列雜交，而與模板中出現(xiàn)的其它序列的雜交可以忽略不計(jì)。一般引物與模板中非靶序列發(fā)生4個(gè)或更少連續(xù)堿基互補(bǔ)都不會(huì)在電泳時(shí)體現(xiàn)出來。

　　PCR反應(yīng)的效率影響特異性產(chǎn)物的積累，根據(jù)Chien等人給出的靶序列的累積與循環(huán)數(shù)的函數(shù)關(guān)系，擴(kuò)增效率高的時(shí)期為29個(gè)循環(huán)之前的指數(shù)增，之后每次循環(huán)的效率就開始大大降低，產(chǎn)物停止指數(shù)積累，此時(shí)理論上靶序列的拷貝數(shù)已達(dá)到1012，而1012拷貝的特定序列對(duì)于絕大多數(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)已滿足要求，且PCR的許多應(yīng)用尤其是定量實(shí)驗(yàn)都要求擴(kuò)增在指數(shù)生完成，因此，一般PCR反應(yīng)都在29個(gè)循環(huán)之前取出，沒有必要再增加循環(huán)數(shù)。

　　PCR反應(yīng)的忠實(shí)性主要與酶有關(guān)，雖然可以通過改變反應(yīng)緩沖液的條件大大提高忠實(shí)性，但是也遠(yuǎn)比不上更換高保真的聚合酶的效果。聚合酶的高保真能力體現(xiàn)在其擁有3’→5’的外切酶校正活性。需要指出的是，不論是否使用高保真的聚合酶，PCR的過程都有可能有錯(cuò)誤堿基滲入，因此在對(duì)忠實(shí)性有要求的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)PCR得到的序列必須測序驗(yàn)證。